Western blot 灰度定量软件
从原始图片测量 Western blot 条带灰度，扣除局部背景，按对应内参归一化，并将选区、测量值和比值导出 Excel。
免登录练习内置示例。注册后可免费制图，并按账号与设备资格试用完整功能，最长 1 个月。联网验证后，当前设备可离线使用已授权功能 30 天。
每个数值，都能回到原图与选区
逐道选框，统一尺寸
等宽、等高锁定选区尺寸，每个泳道仍可独立上下微调。
独立局部背景扣除
每道分别检查信号与不重叠的局部背景，按原始像素扣除背景。
内参与磷酸化归一化
使用同膜内参，或将磷酸化条带与对应总蛋白条带配对。候选关系可人工核对和调整。
结果一键导出 Excel
一起导出积分密度、归一化比值、样本名和选区坐标，便于继续分析。
从选区到可以继续分析的结果
查看上方 2.1.3 演示对应的 Excel，核对测量值、比值与异常提示。另有计算说明、Provenance 和 Measurements 工作表。示例使用模拟数据。
旧版本练习数据（1.1.x）
把目标与内参的积分密度、归一化比值一起导出，后续分析不用重复抄写。
| 样本 | GSDMD 30 kDa | HSP90 | GSDMD / HSP90 |
|---|---|---|---|
| Control-1 | 197,930 | 569,743 | 0.3474 |
| Control-2 | 345,052 | 596,377 | 0.5786 |
| Control-3 | 454,863 | 569,594 | 0.7986 |
| Drug-1 | 559,450 | 553,452 | 1.0108 |
| Drug-2 | 603,472 | 540,435 | 1.1166 |
| Drug-3 | 653,915 | 520,576 | 1.2561 |
Control-1: 197,930 / 569,743 = 0.3474
这个比值表示该样本中目标信号与内参信号的比例。它不是相对对照倍数。
复核包包含两张完整练习原图、选区坐标、采样像素和预期结果。12 个积分密度与 6 个比值已用原录制构建 1.1.24 的原生计算和独立脚本核对。包内说明介绍如何复算，示例不代替实际实验的线性范围与内参验证。
查看同膜上下裁开的来源关系
同一张膜，上下裁开
六份样本先在同一张膜上。沿虚线裁开后，上半张膜 1-1 检测 HSP90 90 kDa，下半张膜 1-2 检测 GSDMD 53/30 kDa。两片的泳道顺序相同。
每片各有一套配图。把两套图片放在同一个文件夹，再导入和分别核对，就是下面这组练习素材。
开始使用这项功能
核对原图和曝光
选择包含目标与内参条带的 Figure。确认样本对应、条带明暗模式，以及目标和内参各自在有效的线性检测范围内。
核对内参与泳道配对
普通模式使用目标蛋白／同膜内参；磷酸化模式使用磷酸化蛋白／对应总蛋白条带。目标与内参应对应相同样本和泳道顺序，并核对膜身份与来源分组。人工检查软件建议的对应关系；明确指定的角色和内参会保留。
逐道调整并保存选区
切换“信号选区”和“背景选区”，分别拖动蓝色信号框与绿色背景框。背景选择邻近、无条带且与信号不重叠的区域，检查目标与内参后点击“保存选区”。
计算并核对比值
计算后查看每个样本的目标积分密度、分母积分密度及二者比值。修改选框或配对后，重新检查并计算。
导出并保留测量记录
导出 Excel，核对样本名、目标与内参积分密度、比值及选区记录。无法计算的比值保留为空并注明原因，不作为零处理。保留项目和完整原图；Provenance 工作表记录来源校验值、位深与算法，便于回溯。
分别检查并保存信号与局部背景
- 在“条带灰度定量”中核对条带用途和目标／内参关系。使用仪器导出的无损 PNG 或 TIFF，支持 8/16 位灰度或 RGB。多页 TIFF 导入后按页选择定量来源；JPEG 有损图可用于拼图，不用于定量。
- 软件先建议泳道与背景。批量建议保留已有人工选区。背景不足时可从原图邻近范围重新建议。在条带卡中切换“信号选区”和“背景选区”。拖动蓝色信号框、绿色背景框及边线，分别覆盖完整信号和邻近、无条带且不重叠的局部背景。
- 逐道检查信号和背景，在“核对内参并查看结果”中核对分母及泳道对应，然后点击“计算灰度比值”并导出 Excel。手动调整后可点击“保存选区”，切换后继续复用。修改信号、背景或配对后，应重新检查并计算。
计算方法与结果说明
算法标识 native-local-bg-v3。只按原始图像像素中心计数，每个像素一次。不使用屏幕显示、图像显示调整或旋转插值后的强度。背景 B 为独立背景框的像素均值。N 是信号框的原始像素数，I 是各像素强度。
浅底深色条带
S = N × B − ΣI深底浅色条带
S = ΣI − N × B保留负值，不把每个像素的负贡献截成零。端点像素不再拦截归一化输出。无效分母或不能计算的输入保留原因，不输出Infinity或补造零值。SNR＜3 仅是噪声复核阈值，不是经过认证的检出限。
旧记录保留原算法和原数值。用当前版本重新计算时，需要重新检查独立背景。旧版视频、Excel 和下方 build40 数值不能作为新算法的预期结果。
归一化与结果解释
样本比值 = 目标 ID / 同膜内参 ID
磷酸化模式计算磷酸化条带 ID／对应总蛋白条带 ID。软件中的“总蛋白”指对应蛋白的总表达条带，不是整条泳道总蛋白染色。
如需相对对照倍数，在后续分析中用各样本比值除以指定的对照基准。明确生物学重复与技术重复，按实验设计选择统计方法。判断变化时一并核对原图、饱和情况、曝光和内参稳定性。
Taylor et al. (2013), A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data
旧版本计算复核记录
build1.1.40：同一示例重新计算
对两张 8 位练习原图使用原来的裁剪坐标和六道选区，按 native-roi-v2 重新计算。该历史版本保留原图精度及双线性插值小数，旧版把插值后的像素四舍五入为 8 位整数。12 个积分密度均有小幅变化，因此不能把旧视频或 build40 数字当作 2.0 新算法预期值。
| 样本 | GSDMD | HSP90 | 原录制比值 | build40 比值 |
|---|---|---|---|---|
| Control-1 | 196,661.28 | 570,339.498 | 0.347402 | 0.344814 |
| Control-2 | 347,773.334 | 595,700.301 | 0.578580 | 0.583806 |
| Control-3 | 453,455.721 | 569,879.948 | 0.798574 | 0.795704 |
| Drug-1 | 560,005.848 | 554,410.766 | 1.010837 | 1.010092 |
| Drug-2 | 601,098.838 | 540,119.46 | 1.116641 | 1.112900 |
| Drug-3 | 655,234.915 | 519,953.806 | 1.256137 | 1.260179 |
这些差异只描述这份固定示例的算法对照，不能推断其他实验或临床结果。原图 SHA-256、原始裁剪和泳道坐标、算法标识及完整精度结果都在复核包中。原视频、原 Excel 与原验证包保持不变。
常见问答
软件怎样扣除背景？
软件使用每道单独选定的局部背景均值 B，深色条带计算 N×B−ΣI，浅色条带反向计算。保留负值。原图像素按中心一次计数，显示调整不参与定量。
每个框应该有多大？
信号框包含完整条带，避开邻道与无关信号。独立背景框选择邻近、无条带的区域，不能与信号框重叠。同一比较保持选区策略一致。
HSP90 一定适合作为内参吗？
示例使用 HSP90。实际实验需要验证内参在处理条件下稳定，且未超出线性检测范围。本例的目标与内参来自同一张膜的上下两片，应对应相同样本并核对泳道次序。
内参归一化和 fold change 有什么区别？
软件导出的比值是目标积分密度／分母积分密度。若要表示相对对照倍数，需要再用每个样本比值除以明确选定的对照基准，并记录这一步处理。
不同膜或过曝图片可以直接比较吗？
先检查成像仪的饱和提示和实验的线性范围。饱和会损失可用于定量的变化信息。跨膜比较需要实验设计、共同校准和完整说明，不能仅用软件比值消除曝光或批次差异。
软件会自动给出显著性检验吗？
2.0提供独立的快速灰度分析与生物学重复汇总。先确认独立样本、对应内参和分组，再查看逐样本散点、汇总与适用的统计建议。软件不会从文件数量自动推断生物学重复。