Western blot 灰度定量教程：背景扣除与归一化
从条带选区、局部背景扣除到同膜内参归一化，按图文步骤完成 Western blot 灰度定量并导出 Excel。
开始前准备使用无损 PNG 或 TIFF 原图，确认信号处于已验证的线性范围。在成像软件中检查饱和情况，并验证内参在当前实验条件下稳定。
图文指南
01核对目标条带与内参配对
从 Figure 打开“条带灰度分析”。检查各行用途、目标与内参的对应关系和泳道组名。目标与内参应对应同一样本，并核对膜身份与泳道顺序。
普通模式使用同膜内参计算目标／内参比值。磷酸化模式将磷酸化蛋白与对应蛋白的总表达条带配对；此处“总蛋白”不是整条泳道的总蛋白染色。
02选择条带选区并扣除局部背景
用蓝色信号框包含完整条带，避开邻道，并在同一比较中保持选区策略一致。绿色背景框放在邻近、无条带且不与信号框重叠的位置。手动调整后点击“保存选区”。
怎样扣除背景：浅背景深条带的校正积分密度 = N × B − ΣI。N 为信号选区的像素数，B 为独立背景选区的平均灰度，ΣI 为信号像素灰度之和；深背景浅条带反向相减。查看完整测量方法。
03归一化条带灰度并导出结果
点击“计算灰度比值”。导出 Excel 前，检查目标与内参的背景校正积分密度、目标／内参比值以及异常提示。
归一化比值 = 目标的校正积分密度／内参的校正积分密度。分母无效时，检查比值缺失的原因，不将缺失值替换为零。
Fold change 是后续换算：用每个样本的归一化比值除以明确选定的对照基准。仅作算术示例：样本比值 0.60 除以对照基准 0.30，得到 2 倍。记录对照基准的选择，区分生物学重复和技术重复；倍数变化不等于显著性检验。
下载本页演示的 Excel，查看结果列与异常提示，并将项目和完整原图与分析记录一并保留。
修改选区或内参后，应重新检查并计算。保存选区用于切换条带后复用，不是计算前的逐条确认。比值不能恢复饱和造成的信息损失，也不能自动消除不同膜之间的差异。
方法参考：Taylor 等（2013），A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data。
视频指导
0:29本页使用模拟示例；操作演示录制于 2.1.3。