灰度定量方法与复算资料

开始前

1. 原始 PNG 或单页 TIFF 的8/16位整数灰度或RGB像素进入测量。JPEG可用于制图，但不作为这一算法的科研定量输入。不支持的透明、多页、浮点或CMYK输入会明确提示。

2. 在每道检查信号和不重叠的背景。按像素中心是否落入选区计数，每个源像素只计一次。旋转边界不使用插值后的预览强度。

3. 深色条带净积分 S = N × B − ΣI。浅色条带 S = ΣI − N × B。N为信号像素数，B为背景均值。保留负净值。再计算同一样本的目标净积分/对应内参净积分。

显示调整与测量分开

亮度、对比度、Gamma、黑白场和显示反相不修改原图，也不进入原像素积分。2.0保留算法标识 native-local-bg-v3。历史结果保留当时算法。修改来源、选区或参照关系后重新检查并计算。

输入变化与重新计算

更换来源文件、移动或旋转信号／背景选区、改目标与内参关系，以及改变泳道分组或重复身份后，按当前输入重新检查并计算。历史分析保留原输入与原算法身份，不能直接当作修改后的结果。点击计算时会重新核验源文件。源图缺失或SHA变化的测量不计入当前比值、n或统计。修复来源后再计算。格式损坏的项目应明确报错，保留原文件并用可读备份恢复，不靠改名或手工删字段掩盖损坏。

哪些像素进入计算

以原像素中心判定选区，局部坐标左/上边界包含、右/下边界不包含。相邻泳道不会重复计入同一像素。灰度图读取原生整数值。RGB按编码值计算 I = 0.2126R + 0.7152G + 0.0722B，不做线性化。测量忽略ICC显示色彩配置，EXIF方向先规范化。

位深与输入限制

8位和16位输入保留各自原始数值范围，16位不会先压成8位。只接受单页整数PNG/TIFF，CMYK、多页、浮点和有透明采样像素的选区不能计算。请从采集软件重新导出支持的原始格式。把JPEG改扩展名或另存为PNG不能恢复丢失的测量信息。0或编码最大值仅表示触及编码端点，不能单凭它判断仪器饱和。

背景离散程度与噪声提示

M为背景像素数，至少为2。背景样本方差 s² = Σ(b−B)²/(M−1)，背景SD为√s²。净积分标准误 SE = √[N×s²×(1+N/M)]，假设像素噪声独立且同方差。SNR = S/SE。SE为0时SNR留空。SNR＜3仅作复核启发式，不是经过实验验证的LOD/LOQ。梯度或相关噪声可能不满足这些假设。

结果与提示

端点像素不再触发“复核后才输出比值”的拦截。无效分母或无法计算的输入仍保留原因，不输出Infinity或补造零值。噪声提示不是经验证的检出限。没有提示也不证明实验有效。

复算能证明什么

原积分和同定义背景扣除可以与Fiji复算比较，但两软件一致不等于背景选取合理。例如真实注入信号4000，在梯度背景中选择不同背景可能得到7000或10400。真实实验还需线性范围、曝光和背景适用性证据。

真实实验需要另做验证

在开始比较前预先记录稀释系列、曝光范围、背景选区策略和操作者复核方法。保留各档未经修改的原图、信号与背景坐标，预先定义可接受线性范围、偏差、变异和重复一致性。比较不同曝光、背景位置和操作者所得结果，报告失败与排除理由。这是一份待实施的验证计划，不是本候选已经完成的真实WB实验。数学公式、原像素、Fiji一致、成品运行和真实实验是五个不同层次。

本次本地复核的范围

2026年10月20日的2.0.0候选复核，使用Fiji（ImageJ 1.53t）对28组指定的8/16位合成灰度TIFF进行364项数值校验，最大绝对差为0。另有107项独立统计公式与设计约束复算。这些结果只覆盖登记的输入和定义，不代表ImageJ Gels、滚动球背景、所有RGB/PNG或真实WB实验均已验证，也不证明抗体特异性、生物学独立性或跨日期可比性。

适合放入论文的简短描述

使用 WB Figure Studio 对 Western blot 原图进行灰度定量，扣除各泳道局部背景后，以对应内参归一化目标蛋白信号。按实际分析补充生物学重复数、对照基准和统计方法。

按实际设计运行统计

核对独立样本、设计及跨次可比性后再选择检验，默认不自动运行。独立两组用Welch t检验，独立多组用Welch ANOVA，显式配对两组用配对t检验，完整区组多组用区组ANOVA。预选比较用Holm校正。每组至少2个有效独立样本，缺配对或缺区组不自动丢样。统计可选原比值或自然对数，取对数要求全部为正。

代码、记录与许可

导出的结果记录选区、像素数、背景、来源和算法版本，供核查。SHA用于文件身份与完整性核对，不是防篡改认证。2.0科研复核包的许可仍是未生效草案，尚未提供公开下载。历史材料只对应各自冻结版本。整套软件继续受专有许可约束，复算一致也不构成科学认证。