细胞凋亡 · 抗体测评
Caspase-7
Proteintech · 武汉三鹰 · 27155-1-AP
近期杂带比以前多，但全长减少和低分子量条带变化仍能看出来。
01实验图片
02本次观察
用了约三年
这支抗体之前的 WB 效果不错，最近两次重新使用，整体表现有所下降。我把原来常用的 8% 手工胶换成了梯度预制胶，这两次也省去了封闭，二抗从 1:8000 调到了 1:5000，背景有所增加。这些条件变化可能都影响了结果；就这几次使用感受而言，梯度胶对部分低分子量 caspase 片段的分离不一定更好。
12 孔胶的表现
在 4–20% 梯度胶上，凋亡刺激后约 35 kDa 的 pro-Caspase-7 明显下降，泳道 7–12 中部分泳道几乎看不到全长。约 13 kDa 附近有两条条带，其中一条与杂带重叠；这些小分子量条带可能与进一步加工、降解有关，也可能夹杂非特异信号。加入 caspase 抑制剂的泳道 11，约 20 kDa 条带反而更明显，可能停留在中间加工阶段；LPS + Nigericin 处理的泳道 3、4 也能看到约 20 kDa 的加工条带。
6 孔胶的时间变化
在 4–12% 梯度胶的时间梯度中，30 min、60 min 时，13 kDa 上方的剪切条带逐渐增强；约 60 min 时，全长开始明显减少。到了 120 min，全长基本消失，但低分子量剪切条带没有继续明显增加。对这支抗体，我会把全长和低分子量条带一起看，取样时间也会影响最终能看到的变化。
03蛋白背景
Caspase-7 与 Caspase-3 同属凋亡执行酶，可通过切割 PARP 等底物参与细胞拆解。其前体约为 35 kDa，经上游 caspase 加工、去除前肽并切开亚基间连接区后，形成约 20 kDa 的大亚基和约 11 kDa 的小亚基，组成活性酶复合物。观察 WB 时，可以留意前体与低分子量条带随刺激时间的变化。抗体识别的区段不同，能看到的大、小亚基也会有所不同。
04本次实测条件
- 样本
- 人 THP-1 单核细胞
- 应用
- Western blot（WB）
- 一抗稀释
- 1:3000（本次实测）
- 凝胶
- 4–12% / 4–20% 梯度胶
- 电泳
- 200 V，40 min
- 转膜
- 320 mA，30 min
- 膜
- 0.2 μm NC 膜
- 封闭
- 不封闭
- 二抗
- 1:5000，1 h
- 上样量
- 未记录
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